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原來生物學我們這麼近|淺談COVID-19疫苗所應用的生物科學(2/2)

2021/08/14閱讀時間約 22 分鐘

簡介COVID-19疫苗,製造出可傳送至體內的COVID-19情資時,所應用的生物技術

本篇簡述病毒載體疫苗(AZD1222,AZ)、mRNA疫苗(mRNA1273 ,莫德納)、次單位疫苗(MVC-COV1901,高端)、不活化疫苗( CoronaVac 科興),所應用的生物技術。

以DNA為傳遞資訊的重組腺病毒疫苗:AZD1222 (AstraZeneca,AZ)

COVID-19疫苗:AZD1222
AZD1222所使用的腺病毒載體──AdChOx
其病毒載體源自黑猩猩腺病毒,屬於無包膜雙鏈 DNA (dsDNA) 病毒。所選用黑猩猩腺病毒修飾改裝成病毒載體因為人類對其沒有預先存在的免疫性。藉此期望此病毒載體在體內初次資訊時,不會運送到半路來訊息都還沒送到細胞核內,就被經驗老道的免疫特攻隊們給撲滅了。且病毒載體不具有細胞內複製的功能,也不具有傳染他人的能力,如同卸除武裝色改裝為運送DNA的小貨車
雖然理論上預期大部分的人沒有對AdChOx有預存的免疫反應,但還是有部分的人會對此病毒載體產生非預期性的不良免疫反應,如:過敏。                                                             

此重組病毒內和什麼資訊
其病毒載體內部所載的DNA情報,為全長棘蛋白(NCBI Reference Sequence: YP_009724390.1)。此序列來自中國復旦大學張永振(Yong-Zhen Zhang)教授的團隊,所分享得新冠狀病毒基因資訊(GenBank: MN908947.3),並選用在此資訊中的棘蛋白資料(GenBank: QHD43416.1),載入病毒載體中為疫苗的主要情資,藉此情報運送至細胞核,達成讓細胞協製抗原的目的。
以上所述基因資訊,皆收入於美國國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)中,提供大眾自行參閱及研究。

此重組病毒會不會將外來的DNA內嵌入自身細胞的DNA?
此類的腺病毒在目前已知的機制中,將運送的DNA嵌入宿主DNA的機率極低,其大部分運送入的DNA,會在細胞核內飄遊或掛在核內邊。也因為內嵌宿主DNA機率極低,所以在細胞以有絲分裂(mitosis)增加新細胞的過程時,外來的DNA參與複製的機率也很低,因此在分裂後的新的細胞中可能不會有外源DNA的存在;如此外來的DNA永久性存在體內細胞中的機會更低。且外來的DNA隨著時間越長,被細胞內的酵素清理掉的機率越高,數量也會隨之降低。以病毒載體來說,此改裝的腺病毒是一個相對安全的技術。
此重組病毒是怎樣製造出來的呢?
病毒本身就並沒有靠自己複製,產生新自我的能力,必須命令被感染的宿主細胞協助;再者被改造修飾後的黑猩猩腺病毒,自身並不具有命令細胞產生新病毒的能力。
所以是藉由重組的細菌人工染色體(Bacterial artificial chromosome,BAC),裝載著重組病毒及棘蛋白的基因資訊(此資訊型態為DNA模式)。載有重組病毒資訊的BAC,會藉由電穿孔(Electroporation)技術,以電壓將細胞工廠的膜鬆動,藉此產生小孔,將BAC直接送入體外培養的細胞工廠──T-Rex HEK293(被改造過人胚腎293細胞,且可以協助產生高量蛋白質得細胞株)。並且藉此外送入細胞工廠核內的DNA,大量製造出重組病毒。
重組病毒內載的棘蛋白資訊,在細胞工廠製造重組病毒時,被抑制表達且不生產之。因此細胞工廠表面,理論上出現棘蛋白的機率很低。                                                                                                        

腺病毒載體應用需要注意的項目
  1. 畢竟外裝為病毒載體,需要特別注意免疫系統的反應。
  2. 病毒在體內的壽命,也會影響產品的功效。
  3. 考量病毒載體是否可以有效率包裝情資。
  4. 是否在純化重組病毒時,可以去除大部分在培樣或在離心時的非必要物(如:細胞培養液、細胞碎片、離心時所添加的藥劑等)。
延伸閱讀
病毒載體與COVID-19的相關研究|Viral vectors for covid-19 vaccine development
AZD1222開發時期相關的發表|
ChAdOx1 nCoV-19 vaccine prevents SARS-CoV-2 pneumonia in rhesus macaques
A bacterial artificial chromosome (BAC)-vectored noninfectious replicon of SARS-CoV-2

微脂體(liposome)包覆的mRNA疫苗: mRNA1273 (莫德納;Moderna)

COVID-19疫苗:mRNA1273
mRNA1273的微脂體(liposome)簡介
微脂體的源發概念為──可與細胞膜親融的載體,所以微脂體成分大多與細胞膜組成所相似,磷脂質為主、膽固醇為輔。其中磷脂質為載體的主要架構,藉由疏水端、親水端及是否帶電荷的特性,合成團體、調節膜電位、包覆或乘載運輸物;膽固醇則是穩定此流動性架構的固定支架。
結構組剖面意圖──包覆RNA的微脂體可能構成的型態。脂質體外側圓形為親水端,內側彎曲線為疏水端。左側為雙層脂質體所構成的微脂體;右側兩圖為多層脂質體,可能有可能採取的組裝方式。
我們再進一步了解mRNA1273。mRNA1273粒徑分布範圍在80~100 nm;所組成比例──陽性磷脂質(SM-102):中性磷脂質(Distearoylphosphatidylcholine,DSPC):膽固醇(Cholesterol):DMG-PEG 2000為50:38.5:10:1.5。其中的中性及陽性脂質比例,可調整微脂體的膜電位,所以照此比例合成的微脂體膜電位為正。而細胞膜的膜電位大多偏負,因此膜電位帶正的微脂體與細胞膜有很好的親融性;不只如此,膜電位偏正特性,也有利微脂體在微酸性環境中,包覆偏負電的mRNA。
還有值得一提,處微脂體外層飄動的PEG,像似微脂體的千絲萬手。可別小看他!PEG藉由富有彈性、柔軟,且不容易被捉到的特性,協助微脂體躲避免疫游擊隊捆棒式的吞噬攻擊。提高微脂體將mRNA送入細胞中的機率!
為什麼mRNA疫苗需要包覆?
因為mRNA體外及體內的半衰期都非常短,且打入高量的mRNA在沒有做任何手段的包裝,可能馬上就會被免疫細胞或核糖核酸酶(RNAse) 清掉。且因為mRNA的帶電性及親水性,不利其進入細胞中。因此運用與細胞膜相似的構造,包裹mRNA作為保護及運送的目的,最終期望細胞能轉譯該片段為抗原。
mRNA1273的mRNA序列載有什麼情資?
mRNA1273的mRNA序列資訊中,最主要傳遞的情資是──具有兩個突變位點的全長棘蛋白,分別是K986P及V987P;所以mRNA1273與AZD1222所提供的棘蛋白情資,會稍有不同。而在全長及蛋白上,所突變的K986P及V987P位點,可以讓細胞所製造的棘蛋白結構更加穩定。
蛋白突變位點的表示法,以K986P為例:986是胺基酸在序列的位子;K為原是胺基酸的縮寫,代表原始胺基酸為離胺酸(Lysine);P則是突變後胺基酸的縮寫代表脯胺酸(Proline)。因此K986P可以解釋為,在胺基酸986的位子,已經由脯胺酸(P)代替原始的離胺酸(K)。                                               

且此序列有特別的核糖核酸替代方式──U(尿苷,Uridine)全部被換成N1-甲基假尿苷(N1-methyl-pseudouridine);藉此降低先天性免疫系統對此mRNA的攻擊,並提高mRNA被轉訊成胜肽(peptide)的效率。
此外,此條mRNA序列中的5端及3端,也包含讓mRNA序列穩定的非轉譯區(untranslated region,UTR),還有3端的多腺苷酸尾(3’ poly-adenylation tail,poly A tail),藉此讓序列更安定。
另外也在修飾序列時,配上了5端帽(5’Cap)。完成此修飾的mRNA結構,才會與飄揚在細胞質中,細胞所自製的成熟態mRNA相似。而5端帽在轉譯時,也扮演非常重要的腳色,因為與mRNA是否能成功招攬核糖體(mRNA轉訊成胜肽的工廠)前來,且願意降落協助進行轉譯有關。
這條mRNA與成熟型態的mRNA構造相似,理論上只會待在細胞質並不會入細胞核,也不須入核執行轉訊任務,其轉訓任務的地點位在細胞質。                                                                                   

mRNA1273是怎麼製造原理
此mRNA是在體外合成,藉由T7 RNA 聚合酶(T7 RNA polymerase)的協助,將含有棘蛋白序列、5端及3端的非轉譯區序列,還有poly A tail的DNA模板轉錄成mRNA。之後mRNA會再經由封端酶(capping enzyme )牛痘2′ O-甲基轉移酶(Vaccinia 2′ O-methyltransferase)的協助,於mRNA的5端加帽,完成mRNA的修飾。
接著,mRNA們與脂質們會以1:2.5(mRNA:脂質)的比例,共處於微酸性環境(pH 5.0)。因處微酸環境,陽性脂質(SM-102)會以親水端帶正電荷的特性,吸引帶負電的mRNA;藉機包覆mRNA,並形成包覆mRNA的內層微脂體結構。之後合成物會再佐以其他輔劑,親水及疏水的特性,自行成團並組成微脂體。
微脂體做為載體時的應用注意事項
  1. 如何讓微脂體躲避免疫細胞的辨識?
  2. 微脂體的包覆率及乘載率,以及運輸物被包覆後是否可以呈穩定狀態?
  3. 微脂體在包覆載物後,載體的安定性及在環境中的穩定性。
  4. 製造過程的可否達到包覆載體後無菌,以及不殘留過多的有劑藥劑?
  5. 是否能達到穩定製成,可以產出具有一致性的粒徑範圍,且膜電位正負偏差需小於30 mV的微脂體?
延伸閱讀
mRNA1273所應用的微脂體技術|
Lipid nanocarriers for microRNA delivery
State-of-the-art design and rapid-mixing production techniques of lipid Nanoparticles for nucleic acid delivery
微脂體避免刺激免疫細胞的相關研究|
Impact of mRNA chemistry and manufacturing process on innate immune activation
A novel amino lipid series for mrna delivery: improved endosomal escape and sustained pharmacology and safety in non-human primates
mRNA1273應用修飾mRNA相關的技術|
N(1)-methylpseudouridine-incorporated mRNA outperforms pseudouridine-incorporated mRNA by providing enhanced protein expression and reduced immunogenicity in mammalian cell lines and mice
Impact of mRNA chemistry and manufacturing process on innate immune activation
mRNA1273所應用的棘蛋白相關資訊|
Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation
SARS-CoV-2 mRNA vaccine design enabled by prototype pathogen preparedness
Assessment report:COVID-19 vaccine moderna ── European Medicines Agency

以重組蛋白質表達COVID-19的棘蛋白片段,次單位疫苗──MVC-COV1901(高端及Dynavax)

此疫苗正在臨床試驗中,本篇僅分享其在製照過程中所應用的生物科技,無深入探討疫苗的功效及副作用。                                                                                                                                             
                                                                                                                                                此疫苗由高端(Medigen Vaccine Biologics Corporation,MVC)與Dynavax,以技術授權方式相互合作。
相關合作方案新聞稿詳見|高端疫苗使用美國Dynavax新型佐劑之新冠肺炎(COVID-19)疫苗 獲台灣政府補助

次單位疫苗中所提供棘蛋白資訊為何?
與mRNA1273的棘蛋白資訊源一樣,具有K986P及V987P突變位點的全長棘蛋白(S-2P)。不過,次單位疫苗會直接提供棘蛋白的蛋白結構,不須經由細胞做轉訊的解密任務,將棘蛋白的情資送到免疫演習場上。
簡述MVC-COV1901的棘蛋白製造流程
  1. 將含有S-2P的基因資訊,送至細胞工廠──ExpiCHO-S 細胞(改造後的中國倉鼠卵巢的上皮細胞)。
  2. ExpiCHO-S 細胞做為細胞工廠的任務:協助大量製成棘蛋白的重組蛋白型態;產生蛋白質的型態,為:棘蛋白-切割位-純化用的標籤。細胞工廠在適當的組合此重組蛋白後,會將其運至細胞外。
  3. 分離細胞並收取細胞培養液(內含有棘蛋白)。
  4. 藉由純化蛋白管柱內的吊鉤,以勾出純化用的標籤,藉此將重組棘蛋白從細胞培養液中分離出來。
  5. 再用酵素切割重組蛋白的切割位,釋放出棘蛋白。
  6. 藉膜孔為0.22 uM 的濾膜,以過濾的方式將細菌,和較大的雜質分子篩出(因為其大小大於孔徑),分離出無菌的棘蛋白進行疫苗的配方作業。
體外生產蛋白質可能會遇到的困難點
  1. 蛋白質的結構是否在體外有具有穩定性?
  2. 蛋白質在體外安定的環境參數、最佳藥物佐劑為何?
  3. 蛋白質是否會被運送至細胞外,且具有適洽的水溶性?蛋白質是否黏性過高,要進行結構上的優化?(以利後續的純化製成)
  4. 在蛋白質純化過程,純化標籤、切割位、管柱,以及藥劑的組合,是否會干擾純化,或破壞蛋白質結構?(純化過程需要多次試驗最佳組合,來進行優化製成。)
  5. 純化蛋白質時,是否會堵塞純化時的管柱?(需進行結構優化、純化優化的反覆試驗)
  6. 蛋白質是否會在體外自主性的凝結成團?(不利純化外,會讓蛋白質失去原本的特性,可能還會讓蛋白質無應用價值。)
延伸閱讀
MVC-COV1901研發時期的相關發表|CpG-adjuvanted stable prefusion SARS-CoV-2 spike protein protected hamsters from SARS-CoV-2 challenge

將COVID-19病毒株滅活的不活化疫苗: CoronaVac (科興;Sinovac Biotech )

COVID-19疫苗:不活化病毒疫苗示意圖
CoronaVac選用何哪種COVID-19的病毒株,來生產疫苗
CoronaVac的病毒來源分離自中國一名重症病患,其病毒株編號為 CZ02W-202002。
簡述CoronaVac的不活化病毒製造流程
  1. 病毒株在三級實驗室中經由細胞工廠──綠猴腎細胞(vero cell)所製造。
  2. 分離細胞並收取細胞培養液,細胞培養液中內有大量病毒。
  3. 將病毒浸泡在β-丙內酯(β-propiolactone,BPL),且處於2-8°C 的環境,12-24小時,目的使病毒失活。
    *BPL具有高滅活病毒的效力,對於病毒表面抗原相對較低的抗原損傷的優勢。
  4. 再輔以甲醛失活病毒,於 2-8°C 環境,將病毒浸泡甲醛 4±0.5 小時,
  5. 純化及濃縮病毒(使用 300kDa 膜)。
  6. 使用苯佐酶(benzonase)── 一種核糖酶,進行酵素水解細胞的DNA以及病毒RNA,目的將其片段化。
  7. 進行不活化病毒的回收,以及以0.22µm的濾膜進行最終過濾。
為什麼BPL、甲醛可以失活病毒珠?
  • BPL失活病毒珠的原理
    BPL與DNA或RNA序列中的G( guanine),會產生共價鍵結,藉此鍵結進而破壞DNA或RNA的結構,毀損DNA或RNA內載資訊的功能,而使得病毒DNA或RNA沒有傳遞資訊的作用。
  • 甲醛失活病毒珠的原理
    甲醛與DNA序列中的A(adenine)胺基會產生共價鍵結,因此損壞病毒DNA的結構。再者,還會甲醛與蛋白質的胺基鍵結,干擾蛋白質型態,並使蛋白質變性,失去原始的功能。
生產不活化疫苗要格外注意的事項
  1. 在純化重組病毒過程時,要去除大部分在培樣或在離心時的非必要物。
  2. 品管!品管!品管!需要非常注重不活化病毒的驗證試驗,確保每批疫苗都沒有具有感染力的病毒。
延伸閱讀
科興疫苗的製造流程與其疫苗優缺點介紹|
保護力 50% 的中國科興疫苗,值得打嗎?
Development of an inactivated vaccine candidate for SARS-CoV-2
Recommendation for an emergency use listing of covid-19 vaccine (vero cell), inactivated submitted by sinovac
失活病毒的相關原理統整|Inactivated virus vaccines from chemistry to prophylaxis: merits, risks and challenges
以BPL 滅活COVID-19,研發COVID-19疫苗的相關研究|Development of an inactivated vaccine candidate for SARS-CoV-2
高量的 BPL (高於 1:1000 濃度)的滅活COVID-19,會形成病毒聚集體,還有使得病毒失去表面的抗原的完整性| Inactivation of SARS-CoV-2 by β-propiolactone Causes Aggregation of Viral Particles and Loss of Antigenic Potential

延伸Q&A

Q:給予整顆不活化的病毒株做訓練免疫訓練,與僅提供棘蛋白單位參與免疫演習,有何差別?
A:給予越精確的棘蛋白情報,體內的免疫部隊越能通過演練,迅速的培訓特工精兵。但並非沒有弊端。若突變病毒已經改變部分進攻策略,且情資已經與疫苗提供的資訊相左,這時候的疫苗功效會降低。
給予不活化的病毒株,雖然提供的情報資訊較雜,在訓練精兵方面相較之下會略為遜色。不過也是因為有提供病毒結構的其他相關訊息,所以在面對突變性疫苗,理論上具有較高的防守彈性度。但不代表不活化的疫苗一定能培訓出,面對突變病毒的免疫特效部隊。

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