針對治療抗性腫瘤 幹細胞的熱療

^{陳光耀 醫師、博士}

^{台北榮民總醫院腫瘤醫學部顧問}

^{陶聲洋防癌基金會董事長}

^{天主教耕莘醫院放射手術中心特約醫師}

^{菁英腫瘤整合治療中心主持人}

一、#前言雖然癌病治療不斷的進步，但對癌患 整體存活率的改善仍有一定的限制，療後 腫瘤復發常常發生，代表腫瘤中有些癌細 胞躲過了治療或產生了抗性。目前醫學界 一般咸信有部份腫瘤細胞所謂腫瘤幹細胞 （cancer stem cells）是腫瘤再生的細胞。 腫瘤幹細胞降低甚至停止細胞繁殖周期 （cell cycle）的進展和提升受損DNA（去 氧核醣核酸）的修復能力，讓腫瘤幹細胞 比腫瘤其餘多數細胞更能抗拒治療，特稱 為治療抗性腫瘤幹細胞。幹細胞見於腫塊 中氧氣不足（缺氧）的區域，為特殊微環 境（micro environment）所圍繞，所謂腫 瘤幹細胞巢（niche），會支持和調控幹 細胞自身的生長。腫瘤幹細胞和它們的巢 穴最近在原發腦腫瘤的缺氧區在組織化學 染色下微動脈血管周邊觀察到，這是二氧 化碳而非氧氣交換的血管。腫瘤幹細胞具 腫瘤高惡性，為癌患存活帶來負面的預後 因素，應對這細胞群（population）迫切 設計針對性的治療法，但至今只有極少數 成功的範例，有數個企圖將幹細胞趕出巢 穴的白血病臨床試驗正在進行。一項成功 的抗腫瘤幹細胞治療必須具備下列特點：

1）治療要針對巢穴區域的腫瘤幹細胞， 即常規療法的效力難以達到之處。

2）摧 毀或改變維持腫瘤的微環境。

3）毒殺細 胞周期運行中或不參與運行的細胞。

4） 克服會保護腫瘤幹細胞基因受損後DNA 修復的機制。本文提出併用40-43℃局部 熱療能滿足上述條件，以對付腫瘤幹細胞 的抗癌方法。

二、#腫瘤幹細胞 腫瘤的生長和復發是由一小撮特殊的 腫瘤幹細胞所驅動這樣的觀念被重視，只 有約十年的歷史，雖然在急性骨髓白血病 二十年前首先有此觀念，例如那時已證明 CD34+ /CD38- 白血病細胞有能力形成和擴 展成腫瘤，它們原先隱藏在缺氧的造血幹 細胞巢穴中，只占少數比例的變形細胞 內，其他白血病細胞如缺CD34+ /CD38- 特 性則無療後復發的能力。1994年Lapidot 等學者描述腫瘤幹細胞的典型特性至今仍 常規的用來區分這群細胞。腫瘤幹細胞和 正常組織幹細胞共有某些特徵，例如自我 再生（self-renewal）的潛力、無限的增殖 （ proliferation ）、細胞復群 （repopulation）、重建整體組織或器官結構，對腫瘤幹細胞則指重建腫瘤，有時甚 至可由單一幹細胞發動重建或腫瘤復發。

幹細胞的繁殖可來自細胞增殖或源於非幹 細胞退分化（de-differerntiation），而其 可塑性則來自細胞組織微環境的刺激。微 環境因素包括PH降低（酸性增加）、缺氧和炎症；非腫瘤幹細胞退分化為腫瘤幹 細胞除了微環境因素外，亦可因抗癌治療 誘發，例如放療和化療。部分腫瘤幹細胞 的特徵有降低或停止細胞周期的運行並增 加和增強受損DNA修復的能力，因此讓 腫瘤幹細胞比其餘大多腫瘤細胞對治療具 有更強的抗性。

大腦膠質母細胞瘤的腫瘤 幹細胞見於缺氧區域，由血管幹細胞巢涵 蓋，內皮細胞的支持。不同種類的腫瘤幹 細胞已發現若干生物標誌能辨識幹細胞的 存在，有些標誌似能辨識多種腫瘤，有些 腫瘤單獨具有特別的標誌，顯示腫瘤的惡 性度並能預知病人存活特性。咸信腫瘤幹 細胞有驅駛腫瘤復發和對治療的抗性，有 些標誌如醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase）的活性，可顯示對放療和化療 具抗性，表示這群細胞難於用常規抗癌療 法所消滅。

三、#熱療 本文所說的熱療指對生長腫瘤的身體 局部加熱到40-43℃約一小時，這對很多 腫瘤具放射線增敏和化療藥增敏作用。在 臨床上熱療總會和放療或化療合併使用。如在常規治療前使用，熱療會增加血流 量、改善供氧，因剌激氧化基的產生增強 了治療的效果。當血流量增加時會提升氧 氣濃度的水平，改變腫瘤的酸鹼度、扭轉 缺氧和缺營養狀態、形成酸中毒，有利加 強常規治療的效果。當放療同時或稍後給 予熱療，熱療會干擾治療引起的DNA損 傷的修復，因此間接的提供細胞毒殺作 用。

熱療激活熱休克蛋白，引來蛋白分子 的散開，讓細胞失能和死亡。熱療能對所 有病例經由對治療抗性的缺氧細胞群作 用，額外的加強療效。熱療的多重作用機 理讓治療的結果顯著的改善腫瘤局控率、 減少腫瘤轉移、提升病人整體的存活狀況。

#以肉瘤病人為例：放療加上熱療會減 少50%遠端轉移的可能性，而在子宮頸癌 病人，放療加入熱療比單用放療會減少復 發、降低轉移瘤的形成、提升整體存活 率。用化療加熱療治療軟組織肉瘤的一項 第III期臨床試驗顯示把局腫瘤無進展的存 活率提高15%。一個初步的假設認為以上 所見效果至少部份來自熱療經過多管道對 腫瘤幹細胞群的抑制，這一點下面章節會 加以討論。很明顯的腫瘤幹細胞比正常組 織幹細胞對熱療更為敏感。

四、#熱療瞄準驅動腫瘤幹細胞的因素1.治療劍指休眠和抗性的生殖周期細胞 和正常組織幹細胞類似，腫瘤幹細胞 會衍化保護自身的機理以求生存和抗拒治療機理之一是維持細胞在休眠狀態 （quiescent state）。休眠的腫瘤幹細胞的 特徵是RNA含量少、缺少啟動繁殖的分子標誌。休眠的細胞至少部份因為缺氧、 缺乏養分或高細胞密度等因素所促成。生 殖周期外的細胞一般對放射線和DNA毒 殺性化療劑有較低的接受度，因此休眠的狀態可能就是腫瘤幹細胞抗拒治療效應的 重要因子，矛盾的是：當生殖周期中的腫 瘤細胞被消滅、停止癌病的進展，却同時 刺激休眠細胞的繁殖，補充損失了的腫瘤 細胞，讓治療失效。

已知生殖周期內的細胞，當運行到S 期，也就是核酸合成期，會提升其對放射 線的抗性，放射線和熱的合併治療會激活 細胞自休眠的狀態進入S期，繁殖中的細 胞已發現對熱療敏感，同時也對化學治療 藥及放射線敏感。雖然熱療的全部作用機 理尚未完全明白，以前的研究已顯示熱療 會延長細胞周期中G1期轉進S期的時間，且阻擋細胞停留在G2期，熱療也發現降 低休眠細胞中缺氧細胞的比例。因此熱療 合併常規療法會把腫瘤幹細胞趕出休眠狀態，在周期運行中的腫瘤幹細胞更容易受 到抗癌治療的傷害，提高治療效果。

2.#缺氧 氧氣的供給會影響腫瘤的穩態和微環 境。快速繁殖中的固態瘤因血管增生能力 太弱，要維持足夠的供氧大不容易，因此 易於形成缺氧的區域。常見缺氧的腫瘤有 惡性腦瘤、黑色素瘤、子宮頸癌和軟組織 肉瘤等，缺氧的出現和癌患有較差的預後 和發生轉移相關。例如和腫瘤中較少缺氧 成份比較，病人有缺氧的軟組織肉瘤發生 肺轉移的機會顯著升高，無腫瘤存活期較 短；同理，沒有淋巴結轉移但有缺氧的子 宮頸癌比富氧腫瘤的患者，用放射線治療 後有更高遠端轉移的危象，因為氧分子在 放射線照射和化療劑作用時會激發DNA 的損傷，而缺氧降低治療的效應，讓腫瘤 細胞對治療有被保護的作用。無論在胚胎期、成人或惡性腫瘤，缺氧區的存在是所有種類幹細胞巢必備的條 件，缺氧的現象為幹細胞維持在未分化的 狀態、降低DNA被氧化的傷害、刺激向 上調控的分子標誌，形成諸如幹細胞的表 型。

極重要的發現是腫瘤幹細胞的自我再 生和分化的能力在缺氧區域獲得提升。此外幹細胞缺氧的誘導因子α（HIF1α）， 一種放射線照射後和缺氧時呈豐富表達的 蛋白，提升腫瘤幹細胞的繁殖和生存。 HIF1α能直接向上調控Notch訊息管道， 也就是促進腫瘤幹細胞生存和再生的徑 路，在體外實驗減少HIF1α的活性，腫 瘤不會成形。因此之故，缺氧被認為是促 進腫瘤幹細胞的表態、強化腫瘤的成形， 並成為放射抗性的生物標誌。 顯然熱療有對抗缺氧狀態部份的效 應，主要由於刺激血流量，增加血管的滲漏。熱療已在數個臨床研究顯示改善腫瘤 的氧分子供應，這不但見於慢性缺氧區域，即熱療顯著減少休眠細胞，改善供氧 在全部腫瘤細胞群也能偵測到。此外癌細 胞的再供氧（re-oxygenation）帶來腫瘤微 環境的改變，例如減少酸中毒、誘導細胞 中止繁殖和自體吞噬，最後引起癌細胞凋 亡。

3.#免疫反應 只有先把人體免疫系統功能壓制，癌細胞的腫瘤增生才有可能發生。免疫反應 能否消滅癌細胞，關鍵在有無癌細胞關聯 性的抗原表達。此外免疫系統的炎症反應 會增加DNA損傷的負荷，結果會誘導腫 瘤增生。另一方面炎症會提升體溫而激活 特異性熱休克蛋白的產生如70號熱休克蛋 白HSP70，70號熱休克蛋白是強悍的免疫 調節劑，能引領刺激天賦的和後天的免疫 反應對抗變異細胞。不過一旦惡性腫瘤已 經形成，也會產生腫瘤關聯性巨噬細胞， 刺激血管增生而促進癌細胞的生長、侵犯 和轉移。有高量的腫瘤關聯性巨噬細胞， 癌患的預後不良。

CD8+和IFNγ誘發的助 攻T細胞也常在腫瘤微環境中出現，透過 促進因素影響腫瘤的生長和轉移。最近一 項在小鼠懷有腫瘤的研究顯示，以腫瘤幹 細胞的溶解液作免疫注射後，小鼠的血清 含高量腫瘤幹細胞特異性的球蛋白IgG， 如果免疫注射含有補體（complement），小鼠消滅腫瘤幹細胞比免疫注射腫瘤激活樹突細胞的效力高。此外，在體外從腫瘤 幹細胞免疫注射後小鼠分離出的T細胞有 更強殲滅腫瘤細胞的能力。因此來自腫瘤 幹細胞的抗原能直接刺激抗腫瘤幹細胞反 應。另一方面亦有報告謂腫瘤細胞亦會抑 制免疫系統的功能。

放療和化療會刺激抗腫瘤免疫反應， 加入溫和的熱療免疫反應會被強化。熱療 靠激活熱休克蛋白的生產而啟動免疫系 統，壞死腫瘤細胞釋出的熱休克蛋白亦加 入啟動免疫系統的行列，再回頭熱休克蛋白又促發樹突細胞的成熟，帶來系統化的 抗腫瘤反應。另一方面熱療會加強抗原的 表現，有助於免疫系統識別癌細胞。在動 物實驗，熱療亦提升自然殺手細胞的數 量，顯著壓制腫瘤的生長。結論是熱療應 發揮抗腫瘤和抗腫瘤幹細胞的免疫反應。

4.#腫瘤微環境 腫瘤幹細胞群和腫瘤微環境以共生的 關係共存，腫瘤微環境保存和調控腫瘤幹 細胞的可塑性（plasticity）並影響其生 存；很多機理參與兩者之間的雙向溝通， 腫瘤幹細胞能夠增殖，內皮細胞扮演極重 要的角色，內皮細胞分泌一氧化氮，激 活Notch訊息傳遞的徑路、控制腫瘤幹細 胞的命運、自我再生、血管增生、內皮細 胞與腫瘤幹細胞的交互作用等。在大腦生 長的膠母細胞瘤經Notch的訊息傳遞，造 成腫瘤幹細胞對放射線產生抗性，如抑制 本訊息傳遞徑路或抑制血管增殖，能驅逐 腫瘤幹細胞群。此外，纖維母細胞抑制腫 瘤微環境是腫瘤幹細胞增殖和促進血管增 生必備要素。 已知內皮細胞和纖維細胞對熱療極為 敏感，熱療另外可抑制內皮細胞的黏性， 抑制腫瘤幹細胞增生並促進其凋亡。

這連 串的關聯性導至腫瘤幹細胞微環境的重 組，驅逐腫瘤幹細胞的因子，又是維持腫 瘤幹細胞成為幹性（stemness）潛能的要 素，並促進對治療的抗性。

5.#病毒感染 人類腫瘤大約有15%是腫瘤病毒 （oncoviruses）所引起，包括B型肝炎病 毒、EB病毒（Epstein- Barr virus）、乳突 瘤病毒（papilloma virus）或8號泡疹 （herpes）病毒等的感染，皆能引起癌的 發生，幸運的是絕大多數病例健全的免疫 系統能消滅這些病毒，只有少數的病例， 讓病毒感染經過數年甚至數十年緩慢的發 展而為癌病。 己知人類乳突瘤病毒會干預腫瘤幹細 胞群的穩態，最近的研究顯示人類乳突瘤 病毒對刺激腫瘤幹細胞扮演重要的角色， 很可能因生產病毒的 E 6 和 E 7 癌蛋白 （oncoproteins），這些病毒蛋白干擾腫瘤 抑 制 p53 蛋白和視網膜胚細胞瘤 （retinoblastoma） Rb蛋白，摧毀了細胞周 期運作和細胞凋亡的調控。己知E6蛋白過 量的表達會促進子宮頸HPV+腫瘤幹細胞 的幹性和自我再生能力；此外，人類乳突 瘤病毒感染也會改變腫瘤幹細胞的自我再 生和重建多塑性。很可能腫瘤細胞受人類 乳突瘤病毒的感染令腫瘤含腫瘤幹細胞數 目比例有差異，使腫瘤對治療的敏感度不 同。最近的發現熱療會短暫的激活E6號病 毒蛋白，而E6通常在宮頸癌會抑制p53參 與的癌細胞死亡，也有可能熱療阻斷人類 乳突瘤病毒引起癌細胞永生的功能。熱療會刺激免疫功能和腫瘤引起免疫 生產力，後者會影響腫瘤的微環境，熱療亦有成功消滅病毒的能力，不過還要進一 步釐清熱療如何達到抗病毒的效應以及如 何消滅病毒關聯性的癌細胞。

6.#DNA修復 腫瘤幹細胞有很強的DNA修復損傷 徑路的特徵，在胰腺、乳腺和前列腺腫瘤 幹細胞內曾觀察到有高量的主要DNA修 復蛋白包括BRCA1，ATR，ATM等， （腫瘤幹細胞減少DNA修復能力也有報 告過），任何針對腫瘤幹細胞傷害DNA 的治療，除了增加DNA傷害總量，一定 會抑制DNA修愎，而熱療就有這兩種功 效。治療癌病在臨床上提高體溫，首先會 顯示負責修復DNA損傷病灶的徑路被抑 制。熱療時持別會顯示引發BRCA2蛋白 的變質（degradation），讓DNA雙鏈斷裂 後主要的同鏈重組的修補徑路失能。此 外，43℃以上的熱療己證實會干預DNA 鹽基切斷病灶的修補，導至進一步更嚴重 的絞鏈斷裂。干擾DNA修復徑路會嚴重 的增加DNA斷裂量，未及時修補的DNA 傷害病灶累積造成細胞死亡。熱療因抑制 DNA修復而降低腫瘤幹細胞數量已被證 實和報告過。熱療不但抑制放射線照射造 成DNA傷害的修復，而且也抑制AKT的信息傳輸，讓腫瘤幹細胞用以求生的機理 被剝奪。其次，目前己經很了解，熱療引 起蛋白分子降解，再進一步導至DNA損 傷，干預DNA的複製。當熱療和其他治 療併用時，幾乎所有的研究都觀察到其滅 癌功效，也看到有更多受損的DNA（未 修補的DNA），自然也很難區分這是熱 療或其他治療的作用。溫和的熱療功效主 要在影響受損DNA修復的徑路，治療後 要馬上直接檢測斷裂DNA鏈的方法尚未 成功；依Oei等學者綜合文献的報導，熱 療造成DNA損傷（未修補DNA）是間接 效應。

7.#摘要和未來展望 常規放療和化療針對腫塊而不是針對 治療抗性的腫瘤幹細胞，因此造成腫瘤的 復發。復發後的常規治療應該應加入熱 療。本文建議第一線的常規治療加入熱 療，會直接讓腫瘤幹細胞提升其敏感度， 包括引起血管滲漏性增加令化療藥滲透腫 瘤更深的區域；熱療讓氧的濃度升高，令 缺氧癌細胞再供氧，對放療增加敏感性； 增加DNA斷裂，減少損傷DNA修補，因 而癌細胞內累積損傷後的DNA；熱療讓 休眠狀的腫瘤幹細胞在第一次放射線照射 後進入繁殖復群態，增加死亡的機會。

熱療後免疫系統可能被激活，改變腫瘤幹細 胞的微環境，所有這些因素阻止腫瘤幹細 胞產生對治療的抗性。熱療讓腫瘤內缺氧癌細胞對放療和化 療增加敏感性，不過尚不明暸熱療對缺氧 癌細胞的療效來自熱療對腫瘤幹細胞的直 接作用，或先改變腫瘤的微環境令腫瘤幹 細胞對放療和化療更敏感？或者兩種作用 都有。

在直接作用方面，也許熱療直接針 對腫瘤幹細胞，無需對腫瘤幹細胞巢再供 氧作用，不過臨床上顯示熱療的作用透過 再供氧是需要的，也不能排除在缺乏氧化 基的狀態下放療的直接效應是否降低？化療藥對缺氧區的癌細胞的灌注也滅少。換 句話說雖然熱療直接消滅腫瘤幹細胞，常 規治療如缺再供氧和再灌注是否無療效？ 臨床上我們還是要靠常規治療消滅非腫瘤 幹細胞的癌細胞群。由上可知，熱療併用常規放療和化療，對腫瘤幹細胞可直接給予增敏作用， 增敏作用的機理構成熱療臨床應用成功， 反映至少有利治療的部份理由，不過駕御 增敏的機理尚未完全明瞭，目前仍很難以 可取得的研究數據下結論，因熱療對腫瘤 幹細胞的效應很難和合併治療對腫瘤缺氧 部位作用區別，不同療法的各自效應尚待 進一步深入探討，這需要先按不同微環境 的腫瘤模式在臨床前體內和體外動物試驗 找到腫瘤幹細胞特異性的生物標誌。 如有腫瘤幹細胞特異性生物標誌的基 礎下能分離腫瘤幹細胞，就有可能分析熱 療如何作用在腫瘤細胞上。

因此先要釐清 微環境因素如何消滅腫瘤幹細胞，又整個腫瘤如何被消滅。在體內實驗應聚焦於比 較放療和熱療對富氧和缺氧區域腫瘤細胞 的效應。第一步最重要先完成看得到缺氧 區域以利於觀察熱療是否能真的針對這個 區域的癌細胞發生作用，能對不同區域腫 瘤動態反應留下影像也很重要。此外，有 腫瘤幹細胞特異性生物標誌可偵檢及觀察 是否熱療會優先針對腫瘤幹細胞聚居的區 域發生作用、是否能監控到顯示幹細胞特 性的細胞在數目上減少到沒有能力再繁殖 至腫瘤復發的程度。

以上熱療合併常規治療效應的機理能 徹底明暸，則臨床上採用多模式治療，有 效的針對治療抗性的腫瘤類型就有極大的 影響力。

五、結語 消滅所有的癌細胞是替癌患做抗癌治 療的初心，也是抗癌治療極具挑戰的目 標，目前常規的抗癌治療包括放療和化 療，很多時候達不到這個目標，因為腫瘤 內藏存一些癌細胞躲過了治療的傷害或對 治療具有抗性。有一小撮癌細胞稱為腫瘤 幹細胞具有腫瘤啟動、腫瘤進展和腫瘤轉 移的潛力被認為顯得特別重要，腫瘤幹細 胞具治療抗性，腫瘤幹細胞特別之處可能 是癌病治療後復發的驅動因素，因此腫瘤 幹細胞極具研究的吸引力。不過能成功針 對腫瘤幹細胞治療的方法却極為有限。

本文提出熱療，也就是對腫瘤所在的人體局 部給予加熱的療法，是針對固態腫瘤中腫 瘤幹細胞治療帶來很大的潛力。本文首先 描述熱療針對腫瘤中缺氧和缺養分區域的 腫瘤細胞有效的治療，這個區域恰是腫瘤 幹細胞藏身之地，卻是放療和化療治療效 果較差之處。其次有些對腫瘤極具存活和 生長影響力因素如腫瘤微環境、免疫反 應、血管增生、氧分子供應等，熱療都能 提供優化的改變。

第三，熱療能針對多元 的DNA修復徑路給予有利的影響，如在 腫瘤幹細胞內訊息向上調控，減少治療後 損傷DNA的修復。因此從事放療和化療 的腫瘤學醫師如加用熱療的新策略，很可 能讓原來對常規治療具抗性的腫瘤幹細胞 無法逃避合併治療所產生致命的綜合效應。

159期防癌之聲