「見縫插針」的農桿菌

農桿菌將T-DNA插入植物細胞的過程。圖片來源：維基百科

 在二十世紀獨領風騷的農桿菌（Agrobacterium tumefaciens），因為被用來製作基改作物而「惡名昭彰」，但是不可諱言地，靠著農桿菌的協助，科學家們也更加了解許多植物基因的功能。不論是使用農桿菌來製造基因沉默、過度表現或是生成插入突變，使用農桿菌不需要昂貴的設備（如基因槍）、也不需要冗長且後果難料的組織再生，之所以被稱為「窮人的載體」（poor man's vector），真可說是當之無愧！

到底農桿菌是如何將目標DNA插入植物基因體，其中機制已經幾乎都了解了。農桿菌以自己的VirD1與VirD2蛋白把自己的Ti質體（Ti是「腫瘤誘導」tumor inducing的意思）DNA上的其中一股切兩刀，然後這段單股的DNA（被稱為T-DNA，T是轉移[transfer]的意思）被VirD1與VirD2帶離開Ti質體，接著包裝後被送入植物細胞核，然後插入植物基因體。

T-DNA插入植物基因體其實並不需要很長一段的序列都相似。與lambda噬菌體大大不同的是，因為T-DNA只需要5個核苷酸左右的序列相同就可以插入，所以過去的許多研究都發現，農桿菌插入植物基因體可以說幾乎是隨機的！這也就是為什麼可以利用農桿菌製作隨機突變株的原因。

不過，雖然T-DNA插入的位置幾乎是隨機的，但是研究也發現，如果該植物的基因體上存在著雙股DNA斷裂，則T-DNA會優先插入這些地方。這就引發了科學家的好奇。

過去有一些研究發現，某些病原菌會促進其宿主的DNA損傷。所以，科學家們就想，會不會其實農桿菌也具備了在宿主的DNA上面製造雙股斷裂的能力，好讓自己的T-DNA插入更方便更有效率呢？

為了要解開這個謎題，他們偵測了被農桿菌感染的植物細胞是否有出現更多的γ-H2AX。原來，組蛋白H2A有一個變體稱為H2AX，當DNA發生雙股斷裂時，H2AX會被磷酸化，形成γ-H2AX。所以，只要偵測γ-H2AX，就可以知道有沒有發生DNA雙股斷裂。他們也使用了博萊黴素（bleomycin）處理的植物作為陽性對照組。博萊黴素會造成DNA雙股斷裂，如此就知道實驗結果是不是可以使用。

研究團隊在感染後的不同時間點（6、24、48和72小時）進行採樣和分析，以觀察DNA雙股斷裂的變化。另外，他們也用RT-qPCR分析了幾個與DNA修復相關的基因（NAC82、KU70和AGO2）的表現量。

結果發現，農桿菌的感染並沒有讓植物細胞DNA雙股斷裂增加。雖然DNA修復相關基因（NAC82、KU70和AGO2 ） 的表現量的確上升了，但是DNA雙股斷裂並沒有增加。

另外，他們還將一些農桿菌的基因在植物中高度表現，結果發現除了高度表現VirD5蛋白會導致植物組織壞死，其他的蛋白（VirE2、VirE3、VirF和VirD2）對植物沒有什麼影響，而他們全部都不影響植物DNA雙股斷裂的程度。

因此研究團隊認為，農桿菌可能藉由一種目前尚屬未知的機制來活化宿主DNA修復機制，進而引發雙股DNA斷裂，來讓自己可以「見縫插針」，而非直接引起大規模DNA損傷。過去我們以為對農桿菌已經夠了解了，但這個研究告訴我們，農桿菌還有許多未知的謎團等著我們去發現與拆解。

參考文獻：

Lacroix, B., Fratta, A., Hak, H., Hu, Y., & Citovsky, V. (2024). Agrobacterium virulence factors induce the expression of host DNA repair-related genes without promoting major genomic damage. Scientific Reports, 14(1), 24330. https://doi.org/10.1038/s41598-024-75525-8