突破突破光學解析的極限—超高解析螢光顯微術

　　眼睛是靈魂之窗，用眼睛「看」，是一種非常有效的的觀測方式。但是，當被觀看的物體太小，看不到或看不清楚時，人們會利用各種光學技術，如放大鏡，去觀察。不過，傳統的光學技術，有偵測上的極限（太小的東西看不到或看不清楚），只能觀察到次微米的尺度（大概是一根頭髮寬度的1/300），因此大幅限制了光學檢測技術的應用。在許多人的努力下，終於突破了這項極限，開發出「超高解析螢光顯微術」，讓人們可以看到「奈米」的世界（等於或小於一根頭髮寬度的1/1000）。

　　一般來說，當我們觀看一個物體時，需要三個基本物件：被觀察者、光、光感測器（如人的眼睛）；而光源可以是自發光，或是外來光源。我們可以用圖一的示意圖來說明這兩種觀察方式的差異。圖一（Ａ）中，被觀察者是一個燈泡，由於燈泡本身會發光，而發出來的光會入射到人的眼睛。而圖一（Ｂ）中，被觀察者是一個不會發光的足球，所以需要燈泡作為外來光源。燈泡發出的光入射到足球表面會受其影響而改變路徑，之後再射入人眼。無論是這兩種方式的哪一種，過程中，光都會與被觀察者產生交互作用，而改變其方位、強度甚至顏色。換言之，這些光會帶著被觀察者的形貌資訊進入人的眼睛，之後眼睛會再將所收到的訊息傳送到大腦，並由大腦解析出被觀察者的影像。

　　當我們得到了被觀察者的影像，並不代表我們就能知道所有被觀察者的形貌細節。事實上，無論是哪種光感測器，其解析能力都有其極限（也就是太小的東西看不到），此極限被稱為「空間解析度」，我們可藉由圖二的示意圖來理解。當我們觀察一個很小的物體時，由於細節看不清楚，所以看起來就會像是一個「小點」，同理，觀察兩個很小的物體時，看起來就會是兩個小點。假設這兩個小點就像圖二中的兩個藍色亮點，當這兩個亮點距離夠遠的時候，我們可以很容易鑑別出這兩個點，如圖二的左圖所示。當這兩個點靠近，甚至有部分疊合，只要沒有疊合的太嚴重，我們仍勉強可以解析出有兩個亮點，如圖二的中圖所示。但是當這兩個亮點疊合的太嚴重，我們就很難分辨出有兩個亮點，而會將之視為只有一個亮點，如圖二的右圖所示。當這兩個亮點接近到恰好勉強可以分辨出有兩個點（也就是再近一點，就會視為一個點）的狀況下，兩個亮點中心到中心的距離就稱為空間解析度。事實上，空間解析度會與被觀察者與光感測器的距離有關。比方說，筆者有近視眼，做視力檢查時，只能看到視力檢查表上最上面兩排圖案的缺口方向，但是若走近的話就連最下面這排的小圖，也看得清清楚楚。換言之，在近距離下，人眼的空間解析度會比較高。那是不是，光感測器與被觀察者的距離越近，空間解析度就越高呢?實際上並不是這樣，例如我們在看書的時候，會將書本與眼睛調整到適當的距離，太近反倒看不清楚。所以當被觀察者與光感測器的間距在某種特定距離時，這個感測器的空間解析度最佳。

　　當想觀察的物體太小，眼睛的解析能力不足，要怎麼辦呢?這時就叫要借助儀器，例如光學顯微鏡，將物體放大。例如圖三左邊的示意圖中，有兩顆靠的很近的足球。我們不容易憑肉眼判斷，它們是否有碰在一起。這時，將影像放大（如圖三右邊的示意圖），就可以清楚的看出它們沒有接觸。但是無論再怎麼放大，傳統光學技術都有其學理上的極限。例如，人們使用綠光雷射作光源時，最好的光學顯微鏡所能提供的空間解析度大概是250奈米（約略是一根頭髮寬度的1/300），更小的尺寸，就看不清楚了。這時就需要超高解析螢光顯微術。

　　目前已經開發出了許多不同種類的超高解析螢光顯微術，本文介紹其中一種，「光啟動定位顯微術」（photo-activated localization microscopy，PALM）。PALM的基本構思可用圖四的示意圖來理解。圖中有兩個亮點因為過於靠近而無法分辨。這時，我們讓右邊的亮點暗掉（只有左邊的點會亮），這樣就可以標示出左邊亮點的中心位置（如圖四中，右上角紅點的位置）。接著，點亮右邊的亮點，並讓左邊的亮點暗掉，這樣就可以標示出右邊亮點的中心位置（圖四中，中下方紅點的位置）。最後，組合兩個中心位置，就可以將兩個亮點的位置解析出來，如圖四中的左下方圖。更進一步，若現在有許多很接近的亮點，利用類似的方法，就可以將所有亮點的位置標示出來。現在問題來了，這些亮點不是燈泡，也沒有開關，我們要如何控制他們的亮暗呢?實務上，我們會用「螢光染色」的方式來處理。

　　所謂螢光是指，某些物質在照光後，會發出特定顏色的光的一種現象。發出的螢光強度會隨著照射的光強度增加而增加。而螢光物質，可以由許多很小的「螢光分子」構成。PALM就是利用染色的方式將螢光分子黏在想要觀察的樣品表面，而每個分子，就像一個的小燈泡，可以獨立發螢光。圖五為PALM的基本概念示意圖。若圖中藍色的橢圓是要被觀察的樣品，利用染色的方式，讓樣品表面吸附很多小螢光分子（如圖五中的小圓圈）。沒照光時，這些螢光分子不發光（如圖五中白色的小圓圈）。要讓所有分子發螢光，就要照射足夠強的光；若光強度不足，就只能讓一部分的分子發光。若入射光的強度很弱，這時就只會有少數的螢光分子會發螢光（如圖五中紅色的小圓圈）。當人們用光學顯微鏡觀察時，由於大部分的分子不發光，而少數發光的分子又太小（顯微鏡看不清楚細節），因此這些發光分子看起來就像是一個個小亮點。藉此，人們可以標示出亮點的位置。重複這項照光及標示亮點位置的動作，就會發現每張光學顯微鏡的影像中亮點的位置都不一樣。這是由於每個螢光分子多少都會有些差異，而量測的環境，也會隨著時間的不同產生少許的變化所致。若我們取很多張影像並標示出每張影像亮點的位置，並將所有亮點的位置組合再一起，就會得到所有螢光分子的分布圖（如圖五中的左下方圖）。由於螢光分子是黏在樣品的表面，只要螢光分子夠多，那麼螢光分子的分布實際上就反映出樣品的形貌。

　　圖六顯示一個PALM量測大腸桿菌的實例。其中（A）及（B）分別是兩種不同的傳統光學顯微術所量測到的影像；而（C）及（D）則分別是搭配兩種不同的光學顯微術所量測到的PALM影像。大家可以很清楚的看到PALM之影像的解析度遠高於傳統光學顯微術之影像。

　　超高解析螢光顯微術目前廣泛的應用在生醫領域，用於量測各種生物樣品的形貌。由於這項技術可以將量測解析度提升到奈米尺度，讓研究人員可以探索奈米尺度的生物世界，因此對微觀的生物研究，例如細菌行為的探索，有非常大的助益。所以，這項技術預計將可大幅增進生醫領域的進展。

1. https://en.wikipedia.org/wiki/Photoactivated_localization_microscopy.
2. http://highscope.ch.ntu.edu.tw/wordpress/?p=58742.
3. http://scimonth.blogspot.com/2014/12/blog-post_64.html.
4. Johnny Tam et al., Journal of Neurochemistry, 2015, 135, 643.
5. Derek Greenfield et al., PLoS Biology, 2009, 7, e100137.

註：本文獲得〝財團法人國立自然科學博物館文教基金會科普寫作網路平台〞審稿通過。