【愛佳｜特別護士】生醫新貴 外泌體（Exosomes）

內容目錄：

• 外泌體的發現
• 何謂外泌體
• 外泌體的功能
• 外泌體實驗研究
• 外泌體來源
• 外泌體純化的方式
• 結語
• 延伸閱讀

外泌體的發現：

外泌體，是一種細胞分泌的微小囊泡（40~120nm），其中包含有各種生物活性物質，如蛋白質、核酸和激素等。最初，外泌體被認為是細胞代謝的副產物，但近年來的研究發現，外泌體對細胞的溝通和調控，起著重要的作用，對人體的健康和疾病也有著深遠的影響。外泌體能夠傳遞訊息、調節免疫反應、促進細胞再生和修復 (抗衰老)、抑制發炎反應、減緩神經性疾病等，其功能之廣泛令人驚嘆。

Exosomes Biogenesis & Therapeutics – Creative Biolabs

何謂外泌體(Exosome)：

外泌體是內起源於細胞的微小囊泡(small endosomal-derived membrane micro vesicles），透過細胞膜內吞作用及連續內化的產物，最終再通過與細胞膜的融合後外吐釋放，屬細胞外囊泡（Extracellular Vesicles: EV) 的一種。

外泌體的形成過程複雜，大致分為內吞、活性物質分選、融合到胞吐過程。首先，細胞膜(PM)向內凹陷、內吞形成早期內體 (Early Endosome)，早期內體透過胞吞來包裹細胞內容物，形成多腔小囊泡的晚期內體(多泡體Multi-Vesicular Endosomes, MVEs)。由細胞內的晚期內體（MVE）再內陷於多泡狀小體 (MVB, Multivesicular Bodies)形成腔內囊泡（Intraluminalvesicles; ILVs）。而多基囊泡體（MVBs）是一種細胞內含有多個內腔囊泡(ILV)的細胞器、一旦MVBs內含有足夠多的ILVs，MVBs即可以與細胞膜融合，將其內容物包括Exosome釋放到細胞外。這些微小囊泡的生物化學結構是由雙層脂質組成，內含有核酸(DNA(去氧核糖核酸))、RNA(核糖核酸)、蛋白質、醣類、脂質等多種訊號因子，作為細胞間信號傳遞或是細胞間溝通的媒介或橋樑。PS: 不同功能的細胞、所裝載包裹的傳遞訊息（稱之為 Cargo）也不同。內吞的這個動作，將原生細胞上的蛋白質都包在裡面，因此所有EV外層的膜上，一定具有與原生細胞膜上相同的蛋白質(其特有的蛋白質包括 CD9, CD63, CD81等等）。這些外泌體(尤如帶有與原生細胞溝通的通關密碼) 經由細胞外基質( ECM)，經由身體循環系統游移到與原生細胞相同的細胞膜(PM)結合。一旦被結合，外泌體會將其cargo輸送到細胞裡。因為這樣的一個機制，現今醫學，利用基因工程和化學的方法，Exosome有望成為診斷疾病的生物標記及藥物傳遞的載體，如在球狀的外泌體內注入藥物。投放至目標細胞後，即可精準達到投藥的目的及效果。調控生理與病理機制，影響疾病的病理發生機轉。

外泌體的功能：

由於外泌體帶有與親本細胞結合的關鍵密碼。例如由腫瘤細胞分泌的外泌體，意味者包含者與腫瘤相關的標誌物。而這些標誌物的確也在患有癌症的患者的血漿和腹水中同時被診斷與發現。利用基因工程和化學的方法 : 在球狀的外泌體內注入治療藥物。投放至目標細胞後，即能精準達到投藥的目的及效果。

1. 細胞間通訊：外泌體可以攜帶信號分子，如miRNA、mRNA、蛋白質等，通過體液循環系統或直接接觸其他細胞，進行細胞間通訊，調節目標細胞的生理狀態。

2. 免疫調節：外泌體中的蛋白質和核酸可以調節免疫反應，包括促進或抑制免疫細胞的活性，調節炎症反應等。

3. 細胞信號傳導: 外泌體中的信號分子可以通過與受體結合，啟動或抑制目標細胞的信號通路，影響細胞的生物學功能。

4. 廢物處理：細胞通過外泌體將廢物、受損蛋白質等排出體外，維持細胞內環境的穩定性。

5. 腫瘤進展的觀察：一些腫瘤細胞釋放的外泌體可以影響周圍組織的微環境，促進腫瘤的生長、侵襲和轉移。

6. 診斷疾病的生物標記及藥物傳遞的載體

外泌體研究：

雖然近年來在多項臨床研究已顯示，幹細胞有望修復神經系統損傷，但因需以手術植入幹細胞，故仍須面臨細胞植入造成的併發症和形成異位組織的隱憂。

國家衛生研究院細胞與系統醫學研究所李華容副研究員研究團隊歷經7年的研究，發現利用特殊技術刺激間質幹細胞，可分離出具有修復細胞功能的「幹細胞外泌體」(Stem Cell-derived Exosomes) ，並從中鑑定出促使腦神經再生及腦部功能恢復之活性物質。若對大腦受損的小鼠注射幹細胞外泌體，觀察到受損的神經細胞可以長出突觸，神經細胞的數量可以恢復到原本的6成。此研究顯示幹細胞外泌體較間質幹細胞更具有促進組織再生的能力，又能避免細胞植入手術的風險及副作用，對再生醫療帶來新的突破。此系列研究已分別於2019、2020年發表於國際再生醫學權威期刊《STEM CELLS Translational Medicine》，並獲得國外媒體專欄報導。最近，間充質幹細胞(MSCs)對腦梗塞、阿爾茨海默病(AD)和帕金森病(PD)等神經系統疾病的治療效果已多有報導。

外泌體來源:

外泌體可以從所有生物體液中分離出來。血液、體液、尿液、唾液、母乳、羊水、復水，腦法隨液，精液等，都可以發現exosomes的存在。

PS: 許多研究人員將重點放在尿外泌體的分析上，因為尿液可以大量、定期地收集，而且工作量最小。

1. 人體來源: 骨髓、羊水、臍帶血、胎盤、脂肪…

2. 動物來源: 馬、狗⋯⋯

3. 植物來源: 葡萄、葡萄柚、薑、花椰菜、人蔘⋯⋯。由於其純度，穩定性，萃取價格（外泌體組成相對簡單，所以成本也會比較低），使用植物外泌體的一個好處，可以加在保養品裡，台灣法規，動物性外泌體，禁止摻用至產品。

透過天然的方式，所能提取出來的外泌體實在有限。舉個例子: 如果想要獲要獲得脂肪來源的間質幹細胞，就要取得大量人體的脂肪。因此研究員將這些原始細胞，比如幹細胞，脂質細胞…經過複製、培養，把細胞的總量放大，進而培養出足夠的外泌體。

而大量複制後的外泌體純度就是接下來的一個關鍵。培養、複制這些原生細胞的方式，環境、配方，各家廠商都有各種不同的方法，也是廠商的 know-how ，屬高度機密。細胞來源的不同，制程不同，純度不同，大小不同，都會影響外泌體的效果。而外泌體的有效性則可以透過CD9, CD63, CD81的檢測，來判斷效性、純度或濃度。

外泌體純化的方式:

1. 差速離心法 (differential ultracentrifugation, DUC): 基於分子的大小及密度的差而進行分離的方法, 透過依序的轉速，依次去除細胞，細胞碎片，凋亡小體。

2. 傳統的超高速離心: 非常的耗時，且EV的結構完整性，容易受到破裂。

3. 密度梯度離心法: (density gradient ultracentrifugation DGUC) : DUC的進化版。再把密度的因子考慮在內的，達到進一步純化的目的。產量及離心時間會跟著拉長。

4. 粒徑篩析層析法(size-exclusion chromatography, SEC): 透過多孔性的物質做為固定相，借由分子的大小及形狀, 進行分離的方法。速度快，且能保留EV結構的完整性及活性。

5. 沉澱法( precipitation)

6. 免疫親和法(Immune Affinity, IA): 利用抗原，抗體特異性結合的原理，來辨識EVs表面的膜蛋白標記物 (如CD9, CD63, SD81, CD82等)，進而分離EVs 的方法。

7. 超過濾法 (ultrafiltration, UF) : 利用濾膜孔徑的大小，透過離心驅動的超濾離心管，來進行分離。各種純化的演進及變化，就變為各家純化技術的know-how

結語：

長生不老一直是人類追求的夢想，從中國的仙丹到歐洲的聖杯，各種關於長生不老的傳說在世界各地流傳已久。這些傳說多半伴隨著神秘的藥物、神奇的泉水或者神仙的咒語，讓人們對長生不老充滿了幻想和渴望。.

而外泌體的發現為我們實現這個夢想及疾病治療提供了新的可能性。長生不老秘方與外泌體間的關係，既是科學與傳說的交錯，也是一個全新的研究領域，值得我們進一步深入探索和理解。

_{延伸閱讀:}

• _{Exosome – an overview | ScienceDirect Topics}
• _{Membranes | Free Full-Text | Current Knowledge on Exosome Biogenesis, Cargo-Sorting Mechanism and Therapeutic Implications (mdpi.com)}

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