圖片作者：ChatGPT
水稻 （Oryza sativa L.） 是起源於亞熱帶與熱帶的作物，對低溫極為敏感。寒害，尤其若發生在穗分化至抽穗階段（booting stage）時，對花粉發育與結實率會造成重大的影響，導致減產。稉稻（japonica）比秈稻（indica）更耐寒，這使得稉稻可以適應高緯度與高海拔地區的環境。然而，寒害仍然造成中國每年 300-500 萬噸的水稻減產。因此，發掘新的耐寒基因對於水稻育種與糧食安全非常重要。
然後，他們在高海拔地區 、植物生長箱 、深水冷處理 下，測量水稻的結實率（seed setting rate）。
接著他們分析水稻基因組的單核苷酸多態性 （SNP, Single Nucleotide Polymorphism），尋找與耐寒性顯著相關的基因座 。他們發現了位於水稻第 1 號染色體的qCTB1t 這個與耐寒性高度相關的數量性狀基因座（ QTL）。進一步分析顯示， qCTB1t 包含兩個可能的候選基因：Os01g0923600 和 Os01g0923800。
為了確認 qCTB1t 內哪個基因真正影響耐寒性，研究團隊以CRISPR/Cas9進行了基因剔除。他們發現，剔除 Os01g0923600 （命名為CTB3） 突變株的結實率顯著下降，而剔除 Os01g0923800 對水稻耐寒性並沒有影響，證明 CTB3 是 qCTB1t 內的關鍵基因。相對的，將CTB3基因高度表現 的水稻株系，在低溫環境下結實率上升，進一步證明 CTB3 的確可以讓水稻變得不怕冷。
那麼，為什麼秈稻會怕冷呢？它的CTB3發生了什麼事？研究團隊透過分析 525 個水稻品系後發現，在CTB3的啟動子有兩個插入序列（分別為57-bp 和 284-bp ）。而且，大部分（87.1%）的稉稻不具有這兩個插入序列，但是幾乎所有（99.45%）的秈稻都具有這兩個插入序列，顯示這兩個插入序列可能與耐寒性有關。
為了要證實的確是這兩個插入序列影響了水稻的耐寒性，研究團隊在秈稻品系中刪除這兩個插入序列，結果水稻的耐寒性顯著提高，證明這些插入序列是造成水稻耐寒性的重要變異。
既然稉稻和秈稻之間的主要差異是來自於這兩個插入序列，會不會是這兩個插入序列影響了CTB3的轉錄活性呢？也就是說，這兩個插入序列可能就是轉錄因子的結合位點，讓未知的轉錄因子可以透過它們來調控 CTB3 表現。
為了要找到這個未知的轉錄因子，研究團隊使用了 PlantRegMap （植物調控網絡資料庫），來預測哪些轉錄因子可能會結合到 CTB3 啟動子的 57-bp 和 284-bp 區域。結果顯示 TCP 家族轉錄因子 （OsTCPs） 最有可能與 CTB3 啟動子結合，其中尤其是OsTCP19 被評估為最有結合潛力。
所以，到底是不是 OsTCP19 呢？研究團隊以酵母單雜交 （Y1H） 來測試 OsTCP19 是否能夠直接與 CTB3 啟動子進行結合。結果發現，OsTCP19 的確能夠與 57-bp 和 284-bp 區域結合，證明 OsTCP19 可能就是 CTB3 的潛在轉錄抑制因子。
進一步在活體植物組織中測試也發現，OsTCP19 真的能與 CTB3 啟動子結合。以報導基因測試也發現，當 OsTCP19 存在時，CTB3 啟動子的活性顯著降低，顯示 OsTCP19 可抑制 CTB3 表現。
為了瞭解OsTCP19對植物的影響，研究團隊製作了OsTCP19 高度表現與剔除的突變株，測試水稻耐寒性是否有發生改變。結果發現，高度表現 OsTCP19 造成CTB3 表現量下降，水稻的結實率在低溫條件下降低，顯示 OsTCP19 負向調控耐寒性。反之，剔除 OsTCP19 會造成CTB3 表現量上升，水稻耐寒性提高，顯示 OsTCP19 的確是 CTB3 的上游負調控因子。
有沒有可能， OsTCP19 除了作用在 CTB3 上面之外，還有其他的作用呢？
於是研究團隊構建了剔除CTB3和 OsTCP19的雙突變株。結果發現，雙突變株的耐寒性與剔除 CTB3單突變株相同，說明 OsTCP19 的作用就是透過 CTB3 來發揮的，也就是說 OsTCP19 可能是 CTB3 的直接上游調控因子。
到這裡，我們已經明白：OsTCP19是一個轉錄因子，它負責抑制CTB3的表現，使水稻變得比較怕冷；當CTB3的啟動子上的序列發生突變，使OsTCP19無法結合時，水稻就會變得比較不怕冷。
那麼，CTB3是如何讓稉稻變得不怕冷呢？
研究團隊比較了CTB3突變株與野生種的基因表現，結果發現，CTB3 是透過影響糖代謝與能量供應相關基因的表現，來提升水稻的耐寒性。受影響的基因包括：OsTPP1以及幾個糖轉運基因。
OsTPP1 （Trehalose-6-Phosphate Phosphatase 1）是一個磷酸酶，負責將磷酸化的海藻糖（Tre6P，Trehalose-6-Phosphate）的磷酸根去掉。研究團隊發現，CTB3 可直接與 OsTPP1 啟動子結合，讓它的表現量提高，進而降低 Tre6P，促進糖分累積，維持冷害條件下的花粉活力。如此一來，水稻就會變得比較不怕冷！他們測試發現，高度表現CTB3的植物 Tre6P 水平較低，而 CTB3 突變株 Tre6P 水平較高，顯示 CTB3 透過 OsTPP1 影響糖代謝，來影響水稻耐寒的能力。
最後，透過分析不同品系水稻的CTB3與OsTCP19，研究團隊發現，耐寒的水稻CTB3表現量較低，而CTB3的低表現量是來自耐寒型的CTB3與OsTCP19共同成就的。耐寒型的CTB3主要存在於稉稻，源自於中國野生稻 O. rufipogon。耐寒的OsTCP19 也主要存在於稉稻，可能也是起源於中國野生稻，並受到正向選擇。也就是說，OsTCP19 與 CTB3 共同演化，使稉稻更能適應低溫環境。
所以，透過大規模的篩選，研究團隊找到了一個新的耐寒基因CTB3 ，透過影響花粉發育來提高水稻穗期耐寒性。
他們發現，因為CTB3 啟動子內兩段插入序列的有無，影響OsTCP19能否抑制CTB3的表現，而CTB3的表現量高低，會使得水稻變得比較怕冷（低）或不怕冷（高）。
這項研究發現了水稻適應寒害的關鍵分子機制，為水稻耐寒育種提供了新的基因標的，有助於幫助全球水稻生產應對氣候變遷的挑戰。
參考文獻：
Li, J., Guo, H., Lou, Q. et al. Natural variation of indels in the CTB3 promoter confers cold tolerance in japonica rice. Nat Commun 16, 1613 (2025). https://doi.org/10.1038/s41467-025-56992-7
