從十四世紀到十七世紀中葉，波蘭王國與立陶宛大公國聯合成為聯邦、莫斯科沙皇國崛起、顎圖曼帝國對東南歐的征服，導致了長達三個世紀的政治與宗教紛爭，和地緣政治的風雲詭譎，期間烏克蘭王公的應對，以及哥薩克人的崛起與能動性，深刻影響了烏克蘭的命運，也埋下十七世紀中葉後，烏克蘭各地區劇烈變化的種子。
波蘭—立陶宛聯邦
1385年，立陶宛大公約蓋拉（Jogaila，1352/62-1434）與波蘭公主雅德維加（Jadwiga，1373/4-1399）聯姻，並改宗天主教，成為波蘭國王瓦迪斯拉夫二世‧雅蓋沃（Waldyslaw II Jagiello），兩國同歸雅蓋沃王朝統治。當基輔公國在1470年遭廢除後，波蘭化、拉丁化在立陶宛等地影響日深，而羅斯文化的影響日薄，這令信仰東正教的立陶宛貴族感到恐慌，他們透過各種方式，試圖與波蘭抗衡，卻處於弱勢地位。
而在1480年，莫斯科公國吞併諾夫哥羅德，擺脫金帳汗國統治並走向獨立後，宣告自己是全羅斯的主宰者，並侵略立陶宛，奪走切爾尼戈夫（Chernigov）等地區，爭奪基輔羅斯的傳承，宣告要奪回「祖產」羅斯國土，意圖一統羅斯，並自稱沙皇。立陶宛大公更被迫在1494年承認莫斯科是全羅斯最高主宰。
為了對抗莫斯科的侵略，儘管立陶宛貴族不情願，且國王以強制力將大片烏克蘭領土劃歸波蘭，但在莫斯科進逼這一外部壓力下，1569年立陶宛與波蘭仍舊達成盧布林聯合（Union of Lublin），建立由波蘭主導的「波蘭—立陶宛聯邦（Rzeczpospolita，下稱聯邦）」，並確立其國界。而作為兩國國界的盧布林分界線，以及其下的東正教世界，當時被視為波蘭羅斯與立陶宛羅斯，並逐漸成為今日白羅斯與烏克蘭國界的基礎。
被稱呼為魯塞尼亞人（Ruthenians）的烏克蘭人亦曾參與盧布林會議，當時烏克蘭王公貴族們站在波蘭一方，支持成立聯邦。因為立陶宛此時已無力保護化為國界邊境的烏克蘭，來自南方草原的克里米亞和諾蓋韃靼人侵略不斷，成為波蘭領土反能利用波蘭王室軍隊保衛邊境，更使其在波蘭支持下往南方拓展。
此一政治策略的成功，烏克蘭王公領地不斷地向第聶伯河（Dinepr River）中下游等南方拓殖，並由於貴族們給予免稅政策，吸引了大批受重稅壓迫的農民、作為中間商的猶太人前往南方，參與拓殖行列，而此地生產的小麥，使烏克蘭逐漸納入廣大的歐洲穀物貿易圈，參與歐洲頻繁的經貿活動。
隨著政治安定、人口與經濟成長，當時最有權勢的烏克蘭王公康斯坦蒂．奧斯特羅斯基（Kostiantyn Ostrozky，1526-1608）促進了宗教和文化復興，並且在繪製聯邦版圖的地圖上提供資訊，將現實的盧布林分界線、古今羅斯的歷史地理空間連結與貼合，更使「烏克蘭」這個名詞與空間結合，創造了近代烏克蘭的雛形，使「烏克蘭」出現在地圖上，使這個名詞成為當時包含第聶伯河右岸、北至基輔、南至卡尼夫等盧布林分界線以南地區的標註。
哥薩克人
哥薩克（Cossacks）一詞源於突厥語，根據語境不同，意指護衛、自由人或強盜，早期哥薩克人三者兼具，多來自立陶宛境內的烏克蘭人，後定居於第聶伯河等沿岸城鎮，以漁獵與劫掠為生。
當時草原上商路遍布，韃靼人在此進行擄掠奴隸與奴隸貿易，烏克蘭人、立陶宛人等各族都有，而以烏克蘭人為大宗。哥薩克人則常常劫掠韃靼人，並解放他們擄去的奴隸，故立陶宛曾利用哥薩克防備韃靼人，動員哥薩克修築南方防禦工事的王公米哈伊洛．弗什涅維茨基（Mykhailo Vyshnevetsky，1529-1584），即被視為首位哥薩克「統領（hetman）」，哥薩克人也被民間詩歌視作英雄。
16世紀後半葉，農民為躲避「再度農奴化」的重稅，大量烏克蘭農民遷入基輔以南草原地帶定居開發，並加入哥薩克。當時聯邦對哥薩克既控制、利用又提防，但為了因應與莫斯科沙皇國日益頻繁的戰爭，聯邦以「註冊哥薩克（Registered Cossacks）」的制度，將哥薩克納入軍事體系，建立哥薩克部隊，並給予優惠待遇。但是造冊制非永久保障，且時而縮編時而擴張的政策，經常引發哥薩克人與聯邦的衝突與不滿，導致日後持續不斷的哥薩克叛亂。
當時的哥薩克群體內部極為分歧。烏克蘭王公們對哥薩克人的控制力十分有限，且逐漸減弱。而在哥薩克人之間有一套民主制度，他們會選舉自己的「統領（hetman）」來領導自己。哥薩克中的「造冊哥薩克」居住在今日的基輔至切爾卡瑟之間，另一群遠離王室控制、在第聶伯河下游險灘建造「錫奇（Sich）防禦據點、獨立行動的哥薩克群體「札波羅熱哥薩克（Zaporozhian Cossacks）」，他們時常侵擾鄂圖曼帝國及其從屬的克里米亞汗國、摩爾達維亞公國等地，吸引著逃離城鎮和草原的人們加入。
在17世紀初，哥薩克更成為歐洲各國、鄂圖曼和俄國對外政策必須考量的勢力。1613到1618年之間，莫斯科沙皇國的留里克王朝已告絕嗣，波蘭人介入俄羅斯王位政爭，當時哥薩克人即曾兩度作為波蘭人和俄羅斯人的盟友，介入沙皇皇位之爭，並在1618年為聯邦奪回切爾尼戈夫。
哥薩克人亦時不時掠奪鄂圖曼帝國的城市，甚至遠達伊斯坦堡。而在1616年，哥薩克人更襲擊位於克里米亞的販奴中心卡法城，解放所有奴隸。這導致1620年的鄂圖曼大軍入侵，並大敗聯邦軍隊，使聯邦陷入恐慌。然而，哥薩克人在霍京之戰中，由出身札波羅熱哥薩克、襲擊卡法的統領彼得羅．科那舍維奇－薩海達奇內（Petro Konashevych-Sahaidachny，約1582-1622）率領，力阻入侵的鄂圖曼大軍，使聯邦化險為夷，其後他更被波蘭人視作英雄。
但是，哥薩克人這段期間提出的政治社會訴求並未被聯邦接受。而在彼得羅．科那舍維奇－薩海達奇內死後，聯邦更派軍鎮壓哥薩克，並分化東正教會與哥薩克人的關係，於1638年頒發管控法令，將哥薩克視作一種獨立身分，給予哥薩克上層軍官特權待遇，更限制其他人民成為「哥薩克」，並減少在冊哥薩克人數，並重建監視哥薩克人的要塞。
而當時聯邦派往烏克蘭重建要塞的法國工程師博普朗（Guillaume Levasseur de Beauplan，1600-1673）繪製大量烏克蘭地圖，無意中讓「烏克蘭」一詞在17世紀的歐洲製圖師群體得到普及，因此運用和製作地圖的人們往後即以烏克蘭之名稱呼當地。
烏克蘭宗教改革
而在這段時間也正是西歐宗教改革的劇烈時期，不僅導致三十年戰爭，改革的浪潮也向當時沉痾暮氣的東正教會提出挑戰。面對改革浪潮，第一波回應現於王公的宗教復興事業，第二波回應來自利維夫等兄弟會團體，由於主教群體的腐敗與壟斷，他們尋求打破主教對宗教的壟斷，並且透過向君士坦丁堡牧首捐獻他所需要的資金，所以主教們尋求牧首反對時，牧首並未支持他們。
為解決困境，主教們參考1439年拜占庭帝國與羅馬教會合作的佛羅倫斯聯合，請求羅馬教皇讓他們加入天主教會，教皇同意後，信仰天主教的國王波蘭國王齊格蒙特三世（Zygmunt III，1566-1632）在1596年召開布列斯特（Brest）會議，宣告聯邦只有一個東方教會，就是與天主教聯合的聯合教會（又稱東儀天主教會、烏克蘭希臘禮天主教會），並打壓反對的東正教徒，亦對選出的新東正主教不予以承認。
此時東正教徒與新教徒、哥薩克人組成聯合戰線，從議會到公共領域展開全面抗爭和論辯，東正教徒協助哥薩克人宣傳其訴求，哥薩克人則對東正教徒提供武裝庇護。這場教會的結合並沒有強化王室權力，反而是宗教對立削弱了聯邦。
隨後在曠日持久的國王選舉、莫斯科入侵的雙重危局下，為了挽救危局，聯邦議會決定重新接納東正教會，制定法令，使東正教會與聯合教會享有同等權利，確保了東正教會的忠誠，並成功使哥薩克人加入戰爭。這一招也裂解了教會和哥薩克人的聯盟，因為教會不再需要哥薩克人的保護，因此開始倒向聯邦一方。
聯邦議會為了確保東正教會的忠誠，在1633年選出出身摩爾達維亞的東正教貴族彼得．莫希拉（Peter Mohyla，1596-1647）為新的基輔都主教。他在前往基輔並奪取權力後，以「復興」為外衣，大力推動具西化色彩的改革。
莫希拉將修道院學校加以合併與整飭，於1632年建立第一所東正教學院（之後被稱為基輔莫希拉學院），並重建教堂與傳統，標準化宗教信條和聖禮儀式，並建立教育良好、極具戒律的教士階層。他更出版當時東正教世界最具權威的宗教經典，使基輔成為當時東正教世界的重心。
莫希拉的改革使基輔成為東正教世界的領導者、最先進的宗教重鎮，培養的教士成為當時最優秀的群體。最明顯的案例是，儘管莫斯科在1589年已經成為牧首區，高於基輔的都主教，然而莫斯科東正教會卻因為孤立與故步自封，學問落後，無法解讀過往的經典，因此引入了基輔方面對神學的理解與解釋。
當沙皇阿列克謝．米哈伊洛維奇（Aleksei Mikhailovich，1629-1676）被選為沙皇後，為打擊莫斯科東正教會的陳腐，大力支持1652年出任新牧首的尼康（Nikon，1605-1681）推動的改革，而尼康的改革即是師法莫希拉，並將基輔對神學的解釋作為莫斯科東正教會的教義基礎，使莫斯科打破孤立，與世界重新連結。
更重要的是，烏克蘭宗教改革帶來的論爭，促使人們閱讀和論辯關於歷史、東正教徒權利、神學和法案內容，讓羅斯社會從知識長眠中甦醒，對於自身那不論稱為魯塞尼亞（Ruthenia）或烏克蘭民族的身分產生認同感。
結語
波蘭—立陶宛聯邦面臨著莫斯科沙皇國與顎圖曼帝國的進逼，必須要利用哥薩克的力量，才能夠抵抗入侵，然而他們對哥薩克人卻充滿歧視、食言與反覆無常，又分裂東正教與哥薩克之間的連結，這在哥薩克群體之間種下巨大的毀滅種子。聯邦軍隊在1638年鎮壓哥薩克，在第聶伯河興築要塞，為他們贏得了10年和平，然而，這一切都只是一場巨大風暴來臨前的寧靜，隨後而來的大叛亂，將永久改變東歐和北歐地區的地緣政治樣貌，使得此地區脆弱的平衡，朝著俄羅斯稱霸的方向前進。
